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HPLC测定氢溴酸沃赛汀中的有关物质

宋光华1,严莉容1,孔祥瑞1,张  伟1,刘正斌1,罗  雪1,郑  强2,柯  潇1*

(1.成都康弘药业集团股份有限公司,四川 成都 610036;2.成都康弘药业集团股份有限公司 生物大分子蛋白药物四川省重点实验室,四川 成都 610036)

摘要:目的  采用HPLC法测定氢溴酸沃赛汀中的有关物质。方法  采用Waters Xselect HSS PFP色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相A为甲醇-0.02 mol·L-1乙酸铵缓冲溶液(pH4.0,含0.5%三乙胺)(20:80),流动相B为乙腈,梯度洗脱,流速1 mL·min-1,检测波长254 nm,柱温35 ℃。结果  各有关物质的线性范围均为0.5~2.0 μg·mL-1r2>0.999);最低检出限为1.69~2.54 ng;杂质高、中、低浓度的平均回收率为80.0%~120.0%(n=9)。结论  所用方法简便、快速、灵敏,可用于检测氢溴酸沃赛汀中的有关物质。

关键词:有关物质;氢溴酸沃赛汀;高效液相色谱法;同分异构体;检测限;专属性;杂质

 

中图分类号:R917                      文献标识码:A                        文章编号:1006-0103(2017)06-0000-00

DOI10.13375/j.cnki.wcjps.2017.06.000

 

Determination of the related substances in Vortioxetine hydrobromide by HPLC

SONG Guanghua1, YAN Lirong1, KONG Xiangrui1, ZHANG Wei1, LIU Zhengbin1, LUO Xue1, ZHENG Qiang2, KE Xiao1*

( 1. Chengdu Konghong Pharmaceutical Group Co., Ltd., Chengdu, Sichuan, 610036 P. R. China; 2. Therapeutic Proteins Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu Konghong Pharmaceutical Group Co., Ltd., Chengdu, Sichuan, 610036 P.R. China)

Abstract: OBJECTIVE  To detect the related substances in Vortioxetine hydrobromide by HPLC. METHODS  The analysis was carried out on the Waters Xselect HSS PFP column (150 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase A was methanol-0.02 mol·L-1 ammonium acetate (pH4.0, 0.5% trithylamine) (20:80) (A), and the mobile phase B was cetonitrile in gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was 254 nm, and the column temperature was 35 ℃. RESULTS  The linear range of all the related substances exhibiteda good linear relationship from 0.5 μg·mL-1to 2.0 μg·mL-1, and calibration curves showed good liner regression in the range (r2>0.999) . The LOD was 0.15-0.60 ng. The average recovery was 80.0%-120.0% (n=9). CONCLUSION  The method is simple, rapid and sensitive for the determination of the related substances in Vortioxetine hydrobromide .

Keywords: Related substances; Vortioxetine hydrobromide; HPLC; Isomers; LOD; Specificity; Impurity

 

CLC number: R917                      Document code:A                       Article ID: 1006-0103(2017)06-0000-00

 

 

氢溴酸沃赛汀(Vortioxetine hydrobromide)是由Lundheck和Takeda制药公司联合研发的用于治疗成人抑郁症(MDD)的药物[1],于2013年9月30日由美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市,其主要通过增加中枢神经系统(CNS)中五羟色胺(5-HT)的浓度而发挥抗抑郁作用[2]。多项临床试验表明:沃赛汀对于治疗MDD有较好的有效性、安全性和耐受性[3]。氢溴酸沃赛汀的化学名为1-[2-(2,4-二甲基苯硫基)苯基]哌嗪氢溴酸盐,分子式为C18H22N2S·HBr。在合成过程中,难免会存在同分异构体,由此带来的杂质可能会残留在成品中,为保证药物的有效性,应将各杂质与主成分进行分离。现采用HPLC法测定了氢溴酸沃赛汀中的有关物质,解决了同分异构体与沃赛汀难以分离的问题。

1    实验部分

1.1    仪器与试药

LC-2010CHT高效液相色谱仪(日本岛津);Milli-Q纯水系统(美国MA)。氢溴酸沃赛汀(成都弘达药业有限公司,批号:150101,纯度100.6%);杂质E对照品[(1-[2-(2,6-二甲基苯硫基)苯基]哌嗪,批号:14-08-149;纯度97.87%)、杂质K对照品(1-[4-(2,4-二甲基苯硫基)苯基]哌嗪,批号:14-08-150,纯度97.01%)、杂质L对照品(1-[3-(2,4-二甲基苯硫基)苯基]哌嗪,批号:14-08-151,纯度97.16%)(Sinco Pharmachem公司);杂质I对照品(1-[2-(3,5-二甲基苯硫基)苯基]哌嗪,成都弘达药业有限公司,批号:I-141010;纯度95.46%);甲醇、乙腈、三乙胺、乙酸铵、冰乙酸为色谱纯;其余试剂为分析纯。

1.2    方法与结果

1.2.1  溶液的制备  分别精密称取杂质E、I、K、L对照品适量,置同一10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,制成浓度约1 mg·mL-1的杂质混合对照品溶液。另外取氢溴酸沃赛汀样品,置10 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成浓度为10.00 mg·mL-1的溶液,作为供试品贮备液,将其定量稀释10倍,作为供试品溶液。取上述杂质混合对照品溶液与氢溴酸沃赛汀供试品溶液进行混合,作为混合对照溶液。

1.2.2  色谱条件与系统适用性试验  采用Waters Xselect HSS PFP色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相A为甲醇-0.02 mol·L-1乙酸铵缓冲溶液(含0.5%三乙胺,用乙酸调pH4.0)(20:80),流动相B为乙腈,梯度洗脱(0~5 min、80%A,5~30 min、80%~65%A,30~50 min、65%~30%A,50~55 min、30%A,55~55.01 min、30%~80%A,55.01~60 min、80%A),采用二极管阵列检测器,检测波长254 nm,柱温35 ℃,流速1.0 mL·min-1,进样量10 μL。取“1.2.1”项制备的混合对照溶液,在上述色谱条件下进样,记录色谱图(图1)。各化合物的出峰顺序依次为杂质E、沃赛汀、杂质I、杂质L、杂质K;各杂质峰之间、杂质峰与沃赛汀峰间均能良好分离,沃赛汀峰与相邻杂质峰间的分离度为2.29。各杂质名称及结构见表1。

 

1  氢溴酸沃赛汀及各有关物质混合对照品溶液的色谱图

Figure 1  Chromatograms of the Vortioxetine hydrobromide and

 

the related substances solution

 

 

氢溴酸沃赛汀各杂质的名称及结构

Table 1  Chemical names and structures of the related substances in Vortioxetine hydrobromide

 

1.2.3  破坏性试验 取精密吸取氢溴酸沃赛汀供试品贮备液1 mL,共7份,置7个10 mL量瓶中。第1份加甲醇定容;第2份加入1 mL 4 mol·L-1盐酸溶液,于90 ℃水浴中放置2 h后取出、放冷,用氢氧化钠溶液调pH至中性,加甲醇稀释并定容;第3份加入1 mL 4 mol·L-1氢氧化钠溶液,于90 ℃水浴中放置2 h后取出、放冷,用盐酸溶液调pH至中性,加甲醇稀释并定容;第4份加入1 mL 10%过氧化氢溶液,于室温下放置40 min,加甲醇定容;第5份加甲醇约8 mL,置4×103 Lx照度下光照24 h后,加甲醇定容;第6份加超纯水定容,置暗处放置24 h;第7份加甲醇约8 mL,密封,于90 ℃放置1 h后取出、放冷,加甲醇定容。取经上述破坏试验处理后的供试品溶液各10 μL,分别进样,记录色谱图。样品经酸、碱、氧化、光照、高湿以及高温的破坏后,产生的杂质均能有效地与沃赛汀峰完全分离,表明方法的专属性好,能够满足有关物质的测定。

1.2.4  线性关系与检出限的考察  分别精密量取“1.2.1 ”项制备的杂质混合对照溶液,用甲醇逐级稀释,配制成不同浓度的线性对照溶液,分别进样,记录色谱图。以杂质峰面积对浓度进行线性回归,得回归方程分别为:Y杂质E=1.1095×104X+631.38(r2=0.9998)、Y杂质I=1.0637×104X+379.83(r2=0.9999)、Y杂质K=1.7025×104X+727.18(r2=0.9993)、Y杂质L=1.3434×104X+393.41(r2=0.9997),杂质E、I、K、L的线性范围均为0.5~2.0 μg·mL-1。取已知浓度的对照品溶液,经不断稀释后分别进样,记录色谱图,测得杂质E、I、K、L的最低检出限 (信噪比≈3)分别为2.54、2.39、1.69、1.70 ng。

1.2.5  重复性、稳定性与加样回收率试验  按“1.2.1 ”项方法平行制备6份供试品溶液,分别进样,记录色谱图,计算得沃赛汀及杂质E、I、K、L峰面积的RSD分别为0.12%、3.84%、3.80%、2.82%、3.72%,表明方法的重复性良好。按“1.2.1”项方法配制供试品溶液,分别于0、1、2、4、6、8、12、24 h时进样,记录色谱图,考察主成分及各杂质的变化。沃赛汀峰与杂质峰的保留时间与峰面积均无明显变化,并且无明显杂质的增加,表明氢溴酸沃赛汀和有关物质供试品溶液在24 h内稳定。精密量取“1.2.2”项制备的10.00 mg·mL-1氢溴酸沃赛汀供试品贮备液1 mL,共9份,置10 mL量瓶中,分别精密加入浓度约为1 mg·mL-1的杂质混合对照溶液8、10、12 μL,共3组,每组设置3个平行样,用甲醇定容;另制备不加杂质对照液的供试品溶液作为空白溶液;分别进样,记录色谱图,用外标法计算含量。计算得高、中、低浓度样品中,杂质E、I、K、L的回收率分别为97.00%、99.38%、108.65%、110.14%,RSD分别为3.68%、5.22%、5.49%、6.51%(n=9),符合定量分析的要求。

1.2.6  样品有关物质的测定  取氢溴酸沃赛汀供试品,按“1.2.1”项方法制备供试品溶液,并按“1.2.2”项色谱条件进样,记录色谱图。结果检测到的1个杂质,主要杂质及总杂质的含量均为0.01%。

讨论

文中所有的几个杂质对照品均为氢溴酸沃赛汀的同分异构体。这些同分异构体的理化性质均相似,用常规的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱系统难以分离。曾采用Waters Symmetry、Waters Xbridge Phenyl等色谱柱,均无法将杂质与沃赛汀分离。最后在选用了对针对苯基化合物有分离优势的Waters Xselect HSS PFP后[4],杂质峰之间和杂质与沃赛汀峰之间的分离度才有所改善,得到比较好的效果。流动相系统中未加入三乙胺时,主峰的峰形不佳,而添加适量三乙胺后,可得到较好的色谱峰。

 

参考文献:

[1]     Gibb A,Deeks ED.Vortioxetine:First glohal approval[J].Drugs,2014,74(1):135-145.

[2]     Citrome L.Vortioxetine for major depressive disorder:A systeniatic review of the efficacy and safety profile for this newly appmved antidepressant-what is the number needed to treat,number needed to harm and likelihood to be helped or harmed?[J].Int J Clin Pract,2014,68(l):60-82.

[3]     范宁,杨甫德.抗抑郁新药沃替西汀[J].中国新药杂志,2014,23(16):1847-1850.

[4]     李佩,李银峰,王杰晶,等.HPLC法测定肾上腺素和去甲肾上腺素原料药中有关物质[J].现代药物与临床,2013,5:720-723

收稿日期:2016-10-21